Ανάπτυξη καινοτόμων διαγνωστικών εργαλείων για ανίχνευση και
χαρακτηρισμό Kυκλοφορούντων Kαρκινικών Kυττάρων (ΚΚΚ) στο αίμα των ασθενών.
ΑΚΡΩΝΥΜΙΟ JUNBlood
ΚΩΔΙΚΟΣ ΕΡΓΟΥ Τ2ΕΔΚ-01562
Τίτλος (Αγγλικά) Development of innovative diagnostic tools for the detection and
characterization of circulating tumor cells (CTCs) in patients' blood
ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΠΡΟΤΑΣΗΣ
Το έργο αυτό στοχεύει στην ανάπτυξη ενός νέου αποτελεσματικού διαγνωστικού εργαλείου για την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό των Κυκλοφορούντων Καρκινικών Κυττάρων (ΚΚΚ) στο αίμα ασθενών με νεοπλασία. Η υγρή βιοψία είναι ταχέως αναπτυσσόμενο πεδίο και ανήκει στην μοντέρνα εξατομικευμένη προσέγγιση της θεραπευτικής του καρκίνου. Τα Κυκλοφορούντα Καρκινικά Κύτταρα (ΚΚΚ) είναι η ακρογωνιαία λίθος της υγρής βιοψίας. Πρόκειται για κύτταρα που εξέρχονται του πρωτοπαθούς όγκου πολύ νωρίς κατά την ογκογένεση μπαίνουν μέσα στα αγγεία και μεταναστεύουν σε άλλα όργανα, δημιουργώντας τις μεταστάσεις οι οποίες είναι κυρίως υπεύθυνες για την κακή έκβαση της νόσου. Είναι λοιπόν χρήσιμο να εντοπίζεται εγκαίρως η διασπορά των ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών. Επίσης τα ΚΚΚ διαθέτουν ιδιαίτερα φαινοτυπικά και μοριακά χαρακτηριστικά που τα καθιστούν ανθεκτικά στην συνήθη χημειοθεραπεία. Συγκεκριμένα πρόκειται για κύτταρα συνήθως μη πολλαπλασιαζόμενα, που συχνά έχουν απωλέσει των επιθηλιακό τους χαρακτήρα και επομένως βρίσκονται σε επιθηλιο-μεσεγχυματική μετατροπή (EMT). Είναι λοιπόν αδύνατο να εντοπιστούν και να χαρακτηριστούν με επιθηλιακούς δείκτες όπως είναι οι Κυτταροκερατίνες που συνηθώς χρησιμοποιούνται μέχρι σήμερα. Από την άλλη πλευρά οι μεσεγχυματικοί δείκτες που έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων στο αίμα, όπως η βιμεντίνη, εκφράζονται σε πολύ μεγάλο ποσοστό στα κύτταρα του αίματος, καθιστώντας την διάκριση των ΚΚΚ αδύνατη μέσα στο δείγμα. Πρόσφατες μελέτες του εργαστηρίου μας σε ασθενείς με καρκίνο μαστού, ανέδειξαν ένα νέο συνδυασμό βιοδεικτών που μπορεί να χαρακτηρίσει αποτελεσματικά τα ΚΚΚ. Συγκεκριμένα η συνδυασμένη ανίχνευση του υποδοχέα χημειοκίνης CXCR4 και του μεταγραφικού παράγοντα JUNB μπορεί να διακρίνει αποτελεσματικά τα ΚΚΚ στο αίμα των ασθενών. Ποσοτικοποίηση δε της έκφρασης των πρωτεϊνών αυτών έδειξε πως τα κύτταρα του αίματος εκφράζουν πολύ χαμηλά ποσοστά του μεταγραφικού παράγοντα καθιστώντας το JUNB ένα πολύ καλό βιοδείκτη για την αναγνώριση των καρκινικών κυττάρων στο αίμα. Επιπλέον εντοπίστηκαν σε περισσότερους από τους μισούς ασθενείς κύτταρα αρνητικά για κυτταροκερατίνες, αλλά θετικά για JUNB με χαρακτηριστικά νεοπλασματικών κυττάρων (ΚΚΚ), υποδηλώνοντας πως το JUNΒ είναι αποτελεσματικότερος βιοδείκτης από τις κυτταροκερατίνες. Επιπροσθέτως, ασθενείς που είχαν JUNB-θετικά KKK στο αίμα τους είχαν κακή πρόγνωση. Σκοπός λοιπόν του παρόντος έργου είναι: A) να διερευνηθεί με ανοσοφθορισμό και Real time PCR η παρουσία και η προγνωστική αξία της ύπαρξης CXC4/JUNB-θετικών KKK σε μία επιπλέον προοπτική ομάδα ασθενών με μεταστατικό καρκίνο μαστού, προκειμένου να επιβεβαιωθούν τα παραπάνω ευρήματα. Β) να διερευνηθεί η χρησιμότητα της διαγνωστικής μεθόδου και σε άλλους τύπους καρκίνου, όπως αυτός του πνεύμονα (μικροκυτταρικός) ο οποίος είναι εξαιρετικά επιθετικός καθώς επίσης και σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη. Γ) τέλος θα διερευνηθεί ο συνεντοπισμός του JUNB και του PD-L1 στα ΚΚΚ με ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία ροής, προκειμένου να διερευνηθεί αν η ανίχνευση JUNB(+)/PD-L1(+) κυττάρων μπορεί να αποτελέσει ένα βιοδείκτη επιλογής ασθενών για ανοσοθεραπεία πέραν των συνήθων. Η μελέτη του συνδυασμού αυτού επιλέχθηκε διότι το PD-L1 επάγεται από τον JUNB και μελέτες του εργαστηρίου μας έχουν δείξει πως τα μόρια PD-1/PD-L1 εκφράζονται στα ΚΚΚ και μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για την ανοσοθεραπεία. Είναι άλλωστε γνωστό πως τα τελευταία χρόνια η ανοσοθεραπεία έχει επιφέρει επανάσταση στη θεραπεία πολλών τύπων καρκίνου συμπεριλαμβανομένου και του πνεύμονα.
Τα ΚΚΚ παρόλο που η προγνωστική τους αξία έχει τεκμηριωθεί πολλά χρόνια τώρα η κλινική τους χρήση είναι περιορισμένη και αυτό λόγω της δυσκολίας ανεύρεσης και χαρακτηρισμού τους. Το προτεινόμενο έργο λοιπόν έρχεται να διευκολύνει την ανίχνευση αυτών των κυττάρων με την χρήση νέων ειδικών βιοδεικτών γι’ αυτά τα κύτταρα και την δημιουργία ενός εύκολου διαγνωστικού τεστ που θα είναι απλό στην καθημερινή εργαστηριακή πρακτική.
PROPOSAL ABSTRACT
The aim of current study is to develop a new effective diagnostic tool for the isolation and characterization of Circulating Tumor Cells (CTCs) in the blood of cancer patients. The liquid biopsy is a rapidly developing field, belonging to the personalized approach of cancers treatment. The CTCs are the cornerstone of the liquid biopsy. These cells are leaving the primary tumor very early during tumorigenesis, entering the blood vessels and migrating to secondary organs, creating metastasis, which is mainly responsible for the poor outcome of the disease. Therefore the early detection of metastatic dissemination would be very useful for the patients. Furthermore CTCs hold and molecular features that make them resistant to standard chemotherapy Specifically, they are usually non-proliferating cells, they have often lost their epithelial characteristics and therefore CTCs are under epithelial to mesenchymal transition (EMT). Consequently it is impossible to identify and characterize these cells, using epithelial markers such as cytokeratins (commonly used today). On the other hand, the mesenchymal markers such as vimentin, which has been frequently used to detect cancer cells in the blood is also highly expressed in the blood cells, making the detection of tumor cells into the sample, very difficult. studies from our lab in breast cancer patients have revealed a new combination of biomarkers that can effectively characterize CTCs. In particular, the combined detection of the chemokine receptor and the transcription factor, JUNB can effectively discriminate CTCs in the blood stream. Quantification of this expression showed that blood cells express very low levels of JUNB, is a very good biomarker for the identification of cancer cells in the blood. In addition, more than half of the patients harbor cancer cells negative for cytokeratins and positive for JUNB, suggesting that JUNB is more effective biomarker than cytokeratins for the detection of CTCs.JUNB-positive CTCs was a poor prognostic factor for cancer patients. : A) to investigate by immunofluorescence and Real PCR experiments the presence and the predictive value of the existence CXCR4/JUNB-positive CTCs in a prospective and validation group of patients with metastatic breast cancer, in order to confirm the above findings B) to investigate the utility of this diagnostic method to another type of cancer such as lung cancer [(Small cell Lung Cancer (SCLC)] which is extremely aggressive and patients have very poor prognosis. The diagnostic value of the test will be also examined in patients with prostate cancer. C) to identify the co-localization of JUNB by immunofluorescence and flow cytometry experiments in order to define whether JUNB(+)/PD-L1(+) CTCs may represent a biomarker for the selection of patients for immunotherapy, since it has been reported that PD-L 1 is induced by JUNB and recent studies from our group have shown that can be used as biomarkers for immunotherapy. It is well known that immunotherapy has revolutionized the treatment of many types of solid tumors, including lung cancer.
Although the predictive value of CTCs has been documented many years now, their clinical utility is limited, due to the difficulty of their identification and characterization. Therefore the proposed project facilitates the detection of these cells by using new specific biomarkers for CTCs and creating an easy-to-use diagnostic test for everyday laboratory practice.
